化合物体外筛选试验中重要指标介绍
图一 典型的临床前优化模式
早些时候，药物发现主要依赖于偶然的现象和临床医生的经验，现代药物开发的筛选模式最初始于Paul Ehrlich对抗梅毒药物的系统化筛选，经过多年的发展，目前的筛选模式和方法早已发生了巨大的变化，但系统筛选这一核心思想却并未改变。受限于生物技术的发展水平，早些时候药物筛选主要依赖于表型筛选模式，而且每次可以筛选的化合物数量较少。随着生物科技的快速发展，PCR、DNA重组、转染等技术的出现，极大的促进了药物筛选的效率。伴随着新技术的出现，筛选数据的数量和复杂程度也直线上升，在规范化的研发模式中，药物开发分工也越来越细化，负责化合物优化的药物化学家可能并没有相关的生物学或者分子生物学背景，因此对化合物筛选中的一些数据或者术语有清晰的认知和了解，对化合物的优化非常有必要。
图二1999 - 2008上市药物的发现方法总结
目前化合物的筛选主要有两种模式：表型筛选和基于靶点的药物筛选！这两种筛选思路各有优劣，总体上呈互补关系。基于靶点的药物筛选主要用于靶点-疾病相互作用明确的研发过程，将靶点蛋白通过现代生物技术制备出来，然后测试其与待测化合物的相互作用强弱，这种方法的优点是效率高、化合物作用原理清晰，但是前期需要大量的投入以确证目标靶点与疾病的相互关系。表型筛选通常以细胞作为筛选工具，优点是对于靶点还不明晰，或靶点与疾病之间的关系还不明确时的药物开发，具有非常好的效果，常用于First in class药物的研发，缺点在于作用机制不明晰，因此后期还需要复杂的机制研究。表型筛选盛行于药物开发的早期阶段，但是现在越来越多的制药公司对这一方法青睐有加，主要是因为它在新颖药物开发中表现出来的巨大优势（图二）。
化合物的筛选是一项复杂的过程，会产生很多数据，对这些数据进行有效的辨识和分析，是项目成功的重要条件，以下对几种比较重要的数据做一简要介绍。
图三 浓度-响应曲线
在开始筛选时，通常会设置一个固定的浓度或者数值，比如说对于给定作用靶点，半数抑制浓度要小于1 uM，这样去除大部分效果差或者没有效果的化合物，将通过初筛的化合物，再重复测试若干个不同浓度下的响应数据，通常为8到12个1/2Log（浓度）梯度，将得到的浓度-响应信号强度连成一条曲线，就得到了化合物的浓度响应曲线，根据此曲线可以判断评价各个化合物。
在化合物样本量较小的时候，可以采用浓度响应曲线来评价化合物的活性，但是当化合物的数量很多的时候，绘制浓度响应曲线是不可能的，工作量太大，此时通常采用半数抑制浓度IC50。IC50是指抑制剂（酶拮抗剂、受体）将给定刺激所产生效应减小一半时的浓度，这个数值的意义由活性测试本身所确定，比如说基于酶活性的测试，IC50表示化合物对酶活性的抑制效果；如果是GPCR的活性测试中，只是表示化合物对GPCR放射性标记配体的取代效果，并不代表其产生的生理活性。另外，测试条件，如底物/配体浓度、辅因子浓度以及初始刺激强度等也会影响结果，因此，对于IC50这个数值的理解，要根据具体的测试条件以及数据采集方式来定。
图四 化合物平衡解离常数公式
虽说IC50是一个非常重要的化合物活性比较工具，但是仍然有局限性，带有一定的经验性，而且不能体现化合物与靶点生物大分子结合能力的强弱，这时需要引入一个新的参数：化合物解离常数K，化合物解离常数的定义是：测试体系中【配体的浓度】与【蛋白浓度】乘积除以体系中的【靶点-化合物结合物】的浓度，其意义为半数靶点结合位点被化合物结合时，所需要的化合物浓度，常数K浓度越低，则表明化合物与靶点的结合性越强，反之则越弱。需要注意的是，所有的平衡解离常数K值均带有浓度单位，
在实际应用中，分别以不同的下标来表示不同的测试。Kd表示采用放射性标记配体与靶点结合的平衡解离常数。KB表示在拮抗剂-受体复合物的平衡解离常数，在效能测试中测定，表示对生理反应的拮抗作用。KA表示激动剂-受体复合体的平衡解离常数。Ki则表示在生化结合测试中或酶测试中拮抗剂-受体复合物的平衡解离常数。Km全称为米歇利斯常数，也称为米氏常数，通常用于表示反应速率为最大值Vmax一半时，底物的浓度，常用于衡量底物对酶的结合性。
图五 Scatchard plot
理想模型下，化合物与靶点分子的结合位置仅有一个，然而实际情况并非如此。将目标受体膜或组织在不同浓度的放射性配体环境下培养一段时间后，过滤除去未结合的配体，将已结合的与自由配体的比值（bound/free）为纵坐标，结合配体的数目（bound）为横坐标，得到一条直线，称之为Scatchard作图（Scatchard plot），其斜率为平衡解离常数的负倒数，与横坐标的截距则为单位质量的组织或蛋白的最大结合位点数目Bmax。然后将放射性标记的配体替换为待测化合物，重复同样的操作，得到另外一条曲线，若Bmax保持不变，而直线的斜率减小，则表示待测化合物为竞争性作用。当直线的斜率不变而Bmax减小，则表示待测化合物为非竞争性作用。
图六 化合物浓度-效能曲线
IC50、平衡解离常数K并不能表示待测化合物所产生的生理反应情况，例如在GPCR的体外测试中，这些数值只是表明该化合物将GPCR受体结合位点上天然配体取代掉能力的强弱，并不能体现使GPCR受体产生相应生物效应能力的情况，因此还需要对化合物做功能测试，和浓度-响应曲线的测试方法类似，通常选取8到12个浓度梯度，每个浓度1/2Log（浓度）差异，对于GPCR受体来说，一般通过测定第二信使的浓度来研究化合物的效能，通常，以天然配体与靶点结合后产生的效果表示为100%效能，待测化合物的效能可能大于也可能小于天然配体，将产生最大效应一半时的浓度，称为EC50，将产生的最大效应与天然配体所产生效应的比值称为最大效能Emax。值得注意的是，在不清楚化合物的效能Emax时，仅使用EC50来比较化合物的活性情况是毫无意义的。上图（图六）中化合物2和天然配体的EC50值一样，而且化合物1的EC50值比天然配体的还要高，但不管化合物1还是化合物2，它们所能产生的最大效能均没有天然配体的高。
通常来说，对于简单的靶点，化合物的作用效果比较单一，也较容易理解，如肠肽酶、糖苷水解酶等，仅表现为抑制作用，但是对于比较复杂的靶点，如GPCR、核受体等，涉及到一系列的下游信号转导，化合物所表现出来的效果各有差异，相对于天然的配体，化合物所产生的生物效果可能比天然配体的效果强，也可能比较弱，也可能阻断下游信号通路，因此，对于上述几种作用结果，可分为激动剂、部分激动剂、拮抗剂、变构调节剂以及反向激动剂等几种。
将能够引起和天然配体一样效应的化合物称之为激动剂，对于虽然能够产生和天然配体一样效应的化合物，但是其效果并没有天然配体的效果强，称之为部分激动剂。对于那些既不会产生激动效应、也不会产生抑制效应，但是能够和靶点相结合、结合能力比天然配体强的化合物，称之为中性激动剂，需要了解的是，虽然中性激动剂不会产生正面或者负面的效应，但是它占据了结合位点，因而表现出“沉默效应”，也称之为拮抗剂。
图七 化合物的作用效果
靶点生物大分子并不是想象中的只有“开”和“关”两种状态，本质上，这些系统处于一个平衡中，以GPCR为例来说明：当未有天然配体或者激动剂存在时，一部分GPCR受体于激活状态时的构象，而一部分则表现为静息状态下的构象，只不过静息状态的构型处于主导地位，但绝不是100%全都是静息状态，此时所表现出来的活性称之为“基底活性（BasalActivity）”，加入激动剂后，使得该平衡中处于激活状态的受体数量增加，总体上表现出激活作用；当加入的化合物能够稳定GPCR的静息构型，平衡中处于静息状态的受体数量增加，表现出与激活状态时相反的效应，那么就称该化合物为“反向激动剂”。
图八 变构（别构）调节剂
调节靶点（生物大分子）性质最直接的方式就是设计出合适的化合物，与靶点上天然配体相结合的位置相互作用，而这个位置称之为正构结合位点，但是也存在其他的结合位点，通常该位点和正构结合位点相距较远，小分子化合物与该位点结合，能够改变靶点分子的构象，增强靶点功能的化合物称为正向变构调节剂，反之则称为负向变构调节剂。在很多情况下，如果缺失配体，仅有变构调节剂的存在不会影响生物系统的功能，以GPCR为例说明，当有正向变构剂存在时，能够促进配体与GPCR受体的结合，从而产生相应的调节响应，但是如果没有配体存在，仅有变构调节剂，则GPCR受体不能被激活。苯二氮卓类药物就属于伽马氨基丁酸受体变构调节剂，目前已有30多种苯二氮卓类药物，广泛用于焦虑、惊慌症、失眠等疾病的治疗。
一般我们都会认为，受体和下游的信号传导系统存在着一一对应关系，按照此假设，如果想要产生最大的信号响应，则需要将细胞表面的受体全部激活才行，然而事实并非如此，实际上细胞表面的受体仅需被激活一部分，就能达到最大的信号响应，此时，胞内的信号传导已达到饱和状态，因此，被激活受体的百分比相比实际的数量更有意义，举例来说，假如在不同的组织细胞表面表达了同一种受体，但是其中一个组织的细胞（A细胞）表面受体表达数量较另一个（B细胞）更多，在同样的配体浓度下，B细胞表面约十分之一的受体被激活，而A细胞表面则仅有百分之一的受体被激活，此时A细胞仅能产生较小的细胞响应，而B细胞则表现出最大的响应，由此，可以选择性的激活B而使A处于沉默状态，但如果目标调节是A，则B细胞就会不可避免的被激活。如果采用受体过表达的细胞做体外筛选，得到的化合物在体内实验时，其活性会比体外测试的更强，因为正常细胞表面的受体含量远低于筛选模型细胞。
化合物的体外筛选是药物开发最起始也是非常重要的一个阶段，“读懂”测试数据是决策的基本条件，只有各个指标在一个合理的区间内才具有进行进一步优化的价值。
参考：
The practical Medicinal chemistry II，Chapter 3
Basic Principles of Drug Discovery andDevelopment，Chapter 4
A Pharmacology Primer， Glossary of Pharmacological Terms
立即解锁你的掌上专业工具！